摘要：从患病拟穴青蟹（Scylla paramamosain）肝胰腺中分离到2种优势菌株，对2种优势菌株进行了鉴定和特性分析。利用形态学观察、生理生化特性分析和16S rDNA序列测定法对细菌类别进行判定，并采用药敏试验对细菌的耐药性进行分析。结果表明，这2种细菌分别为弧菌（Vibrio sp.）和希瓦氏菌（Shewanella），利用15種抗生素对2种细菌进行药敏试验分析，发现2种细菌对恩诺沙星、氟苯尼考、强力霉素高度敏感，对其他几种抗生素则有一定的耐受性。研究进一步证实了海水致病性弧菌是拟穴青蟹细菌性疾病高发的主要原因，也表明希瓦氏菌可能是一种潜在病原菌，与弧菌协同作用，对拟穴青蟹规模化养殖造成危害，同时也为拟穴青蟹养殖过程中细菌性病害的确定和防治提供参考依据。
关键词：拟穴青蟹（Scylla paramamosain）;弧菌（Vibrio sp.）;希瓦氏菌（Shewanella）;16S rDNA;药敏试验
中图分类号：S943 文献标识码：A
文章编号：0439-8114（2019）02-0096-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.021 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
拟穴青蟹（Scylla paramamosain）俗称青蟹，具有生长快、肉质鲜美、营养价值高等优点，是中国东南沿海重要的经济蟹类之一[1]。近年来，青蟹养殖规模的逐步扩大，但由于养殖配合饲料相对滞后，冰鲜饵料极易导致水质恶化，从而导致青蟹病害日趋严重[2，3]。目前，青蟹常见病害主要有病毒病、细菌病和寄生虫病[4]。其中，已报道的细菌病主要致病菌有非液化摩拉氏菌[5]、辛辛那提弧菌[6]、溶藻弧菌[6]、副溶血性弧菌[6]、嗜水气单胞菌[7]、温和气单胞菌等[8]。由于细菌的复杂性、多样性，在一定条件下给青蟹养殖业造成极大损失。然而中国水产养殖业种类繁多，水生生物学基础研究相对滞后，导致许多病因无法判定，故无法采用有效措施进行防治。弧菌（Vibrio sp.）是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带一鞭毛的革兰氏阴性菌，广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大，是一类条件致病菌。近年来，由于养殖水域生态变化，弧菌已成为海水养殖动物的主要病原菌之一。目前，作为海水养殖动物弧菌病原菌已有较多报道[9-19]。希瓦氏菌属（Shewanella）为革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，具单一极生鞭毛，DNA的G+C含量为43%～55%。腐败希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌是人类和其他生物的潜在病原菌，国内外相继报道了有关希瓦氏菌感染海水养殖动物的研究[20-24]。随着研究深入，淡水养殖动物感染希瓦氏菌的病例也陆续有了相关报道[25-27]。这说明该菌所具有的潜在致病性对水产养殖形成严重威胁，所以必须对该病原菌给予足够的重视。因此，本研究通过对患病青蟹体内病原菌分离、16S rDNA序列分析鉴定病原菌的类别，并利用药敏试验来初步筛选治疗该病的药物，开展典型性青蟹病症的研究，有利于针对不同的病症采取有效的治疗措施，降低经济损失。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源 2017年6月取自浙江省三门县绿洋特种水产养殖专业合作社，送检样品除1只存活外均已死亡，外部观察无明显病症。解剖结果，肉体略发红，鳃明显发黑，已死亡青蟹肝胰腺有明显性肿大。
1.1.2 培养基及试剂 营养肉汤干粉、琼脂干粉、细菌理化特征性鉴定用的培养基和药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司;革兰氏染色液购自南京建成生物工程研究所;PCR扩增试剂购自宝生物工程（大连）有限公司;PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离 在无菌条件下，用酒精棉球擦拭患病青蟹体表后进行解剖，取血、心、肝胰脏和肠等组织样品，分别在营养琼脂培养平板（pH 7.4）上划线培养，28 ℃培养12 h，根据菌落特征，挑取单菌落划线分离。
1.2.2 细菌形态观察 将分离菌接种于培养基平板上，置于28 ℃培养12 h，取菌体涂片，革兰氏染色后用光学显微镜观察菌体形态和染色特征。
1.2.3 16S rDNA序列测定和系统发育学分析 16S rDNA基因序列的扩增采用细菌通用引物，正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增片段大小为1 470 bp。PCR扩增反应体系：10×Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL、10 μmol/L引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL、模板菌液3 μL，ddH2O补足至50 μL。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性4 min;94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并将阳性克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定。根据分离菌的核苷酸测序结果，利用NCBI的Blast检索系统（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）进行序列同源性比较，采用MEGA6软件构建系统发生树，采用邻接法（Neighbor joining method）构建系统发育树方法，并通过Boot-strap法检验。
1.2.4 药敏试验 药物敏感性试验按纸片扩散法[28]进行，测定抑菌圈直径，并参照NCCLS判断标准[29]进行敏感性判定。检测的抗生素包括庆大霉素、氟苯尼考、万古霉素、卡那霉素、恩诺沙星、强力霉素、链霉素、新霉素、多粘菌素B、拉氧头孢、阿米卡星、复方新诺明、妥布霉素、呋喃唑酮和头孢唑啉等15種。
1.2.5 致病性试验 将分离菌以3 000 r/min离心收集沉淀，用已经灭菌的0.85%生理盐水，吹打悬浮制成细菌悬液。选取规格相近（150 g）的拟穴青蟹40只，每10只为1组，3组为试验组，1组为对照组。分别给每只青蟹注射0.1 mL细菌悬液（浓度约为1×109 CFU/mL）;对照组每只仅注射0.1 mL无菌生理盐水，相同环境下分别隔离饲养，统计发病率和死亡率。
2 结果与分析
2.1 细菌的形态特征
从患病青蟹肝胰脏组织中分离到2种优势菌，分别标记为QX170601和QX170602。其中，细菌QX170601菌体短小、弯曲成弧形或直杆状，具有一端单一鞭毛，初步判定为革兰氏阴性菌;细菌QX170602菌体短杆状，弯曲，菌落酪黄色，较小，光滑，边缘规整，略凸起，初步判定为革兰氏阴性菌。
2.2 细菌16S rDNA序列鉴定
利用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，获得了菌株的核苷酸序列。将核苷酸测序结果通过Blast比对，发现菌株QX170601和QX170602与弧菌和希瓦氏菌同源性高达99%，选择同源性较高的16S rDNA序列构建系统发育学树，再结合QX170601和QX170602的菌落形态、革兰氏染色情况可以基本判定QX170601为弧菌属，而QX170602与希瓦氏菌为同一属的细菌。
2.3 药敏试验
选取常用的15种抗生素药敏纸片，对弧菌和希瓦氏菌进行药敏试验。结果表明，QX170601和QX170602同时对氟苯尼考、恩诺沙星、强力霉素高敏，对庆大霉素、卡那霉素、呋喃唑酮、头孢唑啉、多粘菌素B、复方新诺明中度敏感，此外QX170602还对拉氧头孢、阿米卡星、妥布霉素中度敏感，对其他抗生素有一定耐药性（表1）。
2.4 细菌致病性试验
青蟹分别接种细菌QX170601、QX170602以及QX170601与QX170602的混合悬液。1 d后观察发现注射菌液的3组青蟹均出现活力下降症状，第4天后，注射JS1501-JS1502混合菌液组青蟹开始出现死亡，直至第7天全部死亡;而第7天注射QX170601的死亡率约为60%;QX170602组死亡率仅为20%，而对照组一直没有出现死亡。结果表明，分离菌QX170601具有明显致死率，在与QX170602的协同作用下毒力更强（表2）。
3 小结与讨论
在青蟹病原菌的诊断过程中，采用了目前正逐步广泛用于养殖环境微生物群落的分析和病原菌鉴定的16S rDNA通用引物PCR扩增法[30，31]，再结合经典的革兰氏染色法、负染电镜观察法，通过细菌形态观察和核酸鉴定，对从患病青蟹分离到的2种菌株进行快速、准确地判定，药敏试验结果表明，这两种菌具有较强的耐药性。
近年来，随着青蟹养殖规模的扩大，青蟹病害日趋严重。到目前为止，研究已经发现弧菌和希瓦氏菌属于条件性致病菌，如青蟹配合饲料缺乏，冰鲜鱼投喂，导致养殖环境不佳时可诱发青蟹感染，从而导致青蟹体色发白，活动能力明显减弱，摄食量减少或不摄食。针对目前青蟹养殖种的病害现状，一方面要注重前期重大病原检测，如苗种引进时可进行规范性检测，降低和杜绝病原的携带，从源头上进行防范;另一方面，针对条件性致病菌，要防止养殖水环境恶化，降低条件性致病菌的暴发率，并对高致死率的病原菌进行综合防治，长期、连续抽样监测，进行防控，也要制备相应的疫苗和有效的药物进行细菌病的阻断遏制。
本研究目的在于对致死率较高、暴发面较广的青蟹病原菌进行确诊鉴定，对其生物学特性进行初步研究，为致病菌的防控提供基础研究数据，便于病害防控数据库的建立。
参考文献：
[1] 谢营梁，施兆鸿，徐咏梅.青蟹Scylla sp.养殖研究现状和发展趋势[J].现代渔业信息，2014，19（1）：14-17.
[2] JITHENDRAN K P，POORNIMA M，BALASUBRANMANIAN C P，et al. Diseases of mud crabs（Scylla spp.）：An overview[J].Indian J Fish，2010，57（3）：55-63.
[3] 郑天伦，黄家庆，孔 蕾，等.浙江省锯缘青蟹养殖病害调查[J].海洋学研究，2009，27（1）：96-100.
[4] 郑天伦.拟穴青蟹病害研究进展[J].水产科学，2014，33（5）：326-331.
[5] 纪荣兴，黄少涛.锯缘青蟹“黄体病”病原菌的研究[J].台湾海峡，1998，17（4）：373-376.
[6] 毛芝娟，卓华龙.锯缘青蟹细菌性传染病的病原菌研究[J].水产科学，2001，20（1）：8-11.
[7] 夏小安，吴清洋，李远友，等.锯缘青蟹混合感染症致病菌的分离鉴定与感染治疗[J].热带海洋学报，2010，29（5）：103-110.
[8] 王海潮，张兴桃，廖红艳，等.锯缘青蟹黄水病病原菌的分离与鉴定[J].安徽农业科学，2011，39（33）：20523-20524，20651.
[9] 殷 战，徐伯亥.鱼类细菌性疾病的研究[J].水生生物学报，1995，19（1）：76-83.
[10] 胡超群，陶保華.对虾弧菌病及其免疫预防的研究进展[J].热带海洋，2000，19（3）：84-94.
[11] 吴后波，潘金培.弧菌属细菌及其所致海水养殖动物疾病[J].中国水产科学，2001，8（1）：89-93.
[12] 常建波，宫向红，孙逢贤，等.养殖牙鲆弧菌病病原菌初步研究[J].海洋水产研究，2001，22（1）：37-41.
[13] 王国良，金 珊，薛良义，等.海水网箱养殖鲈鱼皮肤溃疡病及其病原菌的研究[J].黄渤海海洋，2000，18（3）：85-89.
[14] 林克冰，周 宸，刘家富.海水网箱养殖大黄鱼病原菌研究[J].海洋科学，1999（4）：58-62.
[15] 郑国兴，李 何，黄宁宁，等.文蛤病原菌（溶藻弧菌）的分离与形状及病文蛤组织的电镜观察[J].水产学报，1991，15（2）：85-95.
[16] 沈亚林，于业绍.副溶血弧菌对文蛤的致病性及其防治[J].水产学报，1993，17（3）：249-252.
[17] BARTLY C H，SLANELZ L W. Occurrence of Vibrio parahaemo lyticus in estuarine waters and oysters of New Hampshire [J].Appl Microbiol，1971，21：965-966.
[18] LACOSTE A，JALABERT F，MALHAM S K，et al. Stress and stress-induced neuroendocrine changes increase the susceptibility of juvenile oysters （Crassostrea gigas） to Vibrio splendidus[J].Appl Envion Microbiol，2001，67（5）：2304-2309.
[19] 张晓华，廖绍安，李 筠，等.海湾扇贝病原菌（漂浮弧菌）的研究[J].青岛海洋大学学报，1998，28（3）：426-432.
[20] KORUN J，AKGUN-DAR K，YAZICI M. Isolation of Shewanella putrefaciens from cultured European sea bass，（Dicetrarcbus labrax） in Turkey[J].Revue de Médecine Vétérinaire，2009，160（11）：532-536.
[21] SAEED M O，ALAMOUDI M M，AL-HARBI A H. A Pseudomonas associated with disease in cultured rabbitfish Siganus rivulatus in the Red Sea[J].Dis Aquat Organ，1987，3（3）：177-180.
[22] 吕俊超.养殖大菱鲆病原菌的分离鉴定，组织病理学及免疫组织化学[D].山东青岛：中国海洋大学，2008.
[23] 贾春红，李淑芳，张继东.3株方斑东风螺病原希瓦氏菌对35种常用抗菌药物的药敏性试验[J].江西水产科技，2013（1）：17-19.
[24] 孙 琪，邱军强，杨先乐.希瓦氏菌引起的海马细菌性疾病[A]. 中国水产学会.2012年中国水产学会学术年会论文摘要集[C].北京：2012.
[25] KOZINSKA A，PEKALA A. First isolation of Shewanella putrefaciens from freshwater fish-a potential new pathogen of fish[J].Bulletin-European Association of Fish Pathologists，2004，24（4）：189-193.
[26] PEKALA A，KOZINSKA A，PAZDZIOR E，et al. Phenotypical and genotypical characterization of Shewanella putrefaciens strains isolated from diseased freshwater fish[J].J Fish Dis，2015，38（3）：283-293.
[27] 秦 蕾，张晓君，毕可然.一种新的异育银鲫病原—腐败希瓦氏菌[J].微生物学报，2012，52（5）：558-565.
[28] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物实验[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.62-64.
[29] M100-S18-2008，National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].
[30] KIM M S，JEONG H D. Development of 16S rRNA targeted PCR methods for the detection and differentiation of Vibrio vulnificus in marine environments [J].Aquaculture，2001，193（3-4）：199-211.
[31] PAUNGFOO C，PRASERTSAN P，BURRELL P C，et al. Nitrifying bacterial communities in an aquaculture wastewater treatment system using fluorescence in situ hybridization （FISH），16S rRNA gene cloning，and phylogeneticanalysis[J].Biotechn Bioeng，2007，97（4）：985-990.